黑豆芽葉綠素含量的研究方法
黑豆芽，并不是我們通常所說(shuō)的豆芽，比普通的營(yíng)養(yǎng)成分含量高很多，尤其是里面的葉綠素含量，更是在很多蔬菜中占據(jù)榜首，這些都是經(jīng)過(guò)一系列的研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)，尤其是近代葉綠素儀使用的成熟，使得對(duì)黑豆芽中葉綠素的研究更加廣泛，下面我們一起看下黑豆芽的葉綠素含量研究方法。
黑豆芽，俗稱(chēng)豆苗，口感鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，富含鈣、磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)及多種維生素；而且還具有很高的藥用價(jià)值，其性微涼，味甘，有活血利水、清熱消腫、補(bǔ)肝明目的功效。更為重要的是黑豆芽富含葉綠素。葉綠素分子結(jié)構(gòu)與人體內(nèi)的血液分子相似，非常易溶入紅細(xì)胞中，能抑制細(xì)菌、排出毒素，有“綠色血液”之稱(chēng)。
研究表明，豆芽中的葉綠素能分解人體內(nèi)的亞硝酸胺，能夠起到預(yù)防直腸癌等多種消化道惡性腫瘤的作用。因此，研究黑豆芽的葉綠素測(cè)定提取方法，對(duì)于提高其品質(zhì)和黑豆芽葉綠素深度開(kāi)發(fā)具有重要意義。關(guān)于葉綠素含量測(cè)定方法使用較多的是Arnon法，但是Arnon法需要把植物材料研磨和去殘?jiān)崛r(shí)間長(zhǎng)，工作量和操作誤差大。20世紀(jì)80年代初張憲政提出了丙酮乙醇混合液浸提法，證明利用混合液進(jìn)行葉綠素浸提的可行性，進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)，混合液法比傳統(tǒng)Arnon法提取葉綠素效率高，穩(wěn)定性好，并且洪法水等發(fā)現(xiàn)丙酮與乙醇在等濃度混合時(shí)提取效果最好，明華等認(rèn)為浸提法要優(yōu)于研磨法，混合液浸提葉綠素比單獨(dú)用丙酮或乙醇浸提快，葉片冷凍處理后，快速浸提能夠縮短葉綠素浸提時(shí)間。目前，關(guān)于芽菜葉綠素提取方法鮮見(jiàn)報(bào)道，本文以常規(guī)的Arnon法為基礎(chǔ)，對(duì)研磨法和混合液浸提法進(jìn)行了研究以探討黑豆芽葉綠素含量測(cè)定方法。
1材料與方法
1.1 材料、儀器、試劑
黑豆芽購(gòu)于市場(chǎng)；分光光度計(jì)：浙江托普糧食儀器；萬(wàn)分之一天平：托普儀器；丙酮、乙醇：分析純，按體積比配制浸提液：95%乙醇，丙酮∶乙醇=1∶1，80 %丙酮分別用A、B、C 表示。
1.2 方法
預(yù)處理樣品，取黑豆芽適量，用紗布或吸水紙吸干表面的水分，將子葉等剪成小于 2 mm 碎條， 混勻，分成2份。提取測(cè)量，一份在室溫（25℃）下， 立即用研磨法和直接浸提法（A、B、C 3 種提取液）提取葉綠素。
其中浸提法，稱(chēng)取1g處理好的樣品置于50mL容量瓶中加入相應(yīng)提取液，定容，混勻，封口，置于黑暗條件下直接浸提。待組織完全變白，分別在波長(zhǎng)663、645、470 nm 下測(cè)定吸光度值。另一份用天平精準(zhǔn)稱(chēng)取（1g，9 份），分別裝袋，密封好，放到冰箱冷凍6h，取出以浸提法測(cè)定吸光度值。浸提法、研磨法、冷凍浸提法每個(gè)處理各重復(fù)3次。
1.3 數(shù)據(jù)處理
葉綠素含量的計(jì)算：Ca=12.7A663-2.69A645；式中：Ca為葉綠素a濃度，（mg/L）；Cb=22.9A645-4.68A663；式中：Cb為葉綠素 b 濃度，（mg/L）；C（a＋b）=Ca+Cb；式中：C（a＋b）為葉綠素總濃度，（mg/L）；葉綠素的含量（/mg/g）=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮重；所有數(shù)據(jù)處理用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。
2結(jié)果與分析
2.1 黑豆芽葉綠素含量
各種方法提取結(jié)果見(jiàn)表1。
由表1可見(jiàn)，黑豆芽（不包括胚軸和胚根）葉綠素含量為0.1677mg/g（鮮重），a/b 為2.524。
2.2 不同提取方法的提取效果比較
研磨法、浸提法、冷凍浸提法3種提取方法，對(duì)于葉綠素a、b 提取結(jié)果表現(xiàn)一致，以冷凍浸提法提取效果最好，其次為研磨法，再次為浸提法表2）。
浸提法提取效果最差，一方面可能提取不完全，也可能在提取的過(guò)程中葉綠素有分解，相對(duì)冷凍浸提法，由于經(jīng)過(guò)了冷凍過(guò)程破碎了細(xì)胞，提取完全而且提取過(guò)程快減少了葉綠素分解，效果最好。研磨法在研磨、過(guò)濾等操作的過(guò)程中有損失，而且提取時(shí)間過(guò)程長(zhǎng)造成弱光下葉綠素的分解，效果不及冷凍浸提法。葉綠素含量提取效果的單變量方差分析，見(jiàn)表3。
由表3單變量方差分析表明，葉綠素 a Sig.=0.749，P>0.05，葉綠素 b Sig.=0 .145，P>0.05，即不同提取方法間差異不顯著。
2.3 不同提取液提取效果
比較不同提取液提取效果比較，見(jiàn)表4。
由表4可見(jiàn)，不同提取液提取效果，對(duì)于葉綠素a、b 提取結(jié)果表現(xiàn)一致，以 95 %乙醇提取效果最好，其次乙醇丙酮 1∶1 混合，再次為 80 %丙酮。由表 2 單變量方差分析表明，葉綠素 a Sig.=0.000，P<0.01，葉綠素b表1 黑豆芽葉綠素含量測(cè)量結(jié)果Sig.=0.001，P<0.01，即不同提取液提取效果差異極顯著。進(jìn)一步進(jìn)行不同提取液提取效果多重比較分析表明（表5）。
由表5可知，除葉綠素 b 丙酮乙醇 1∶1 混合提取液和 80 %丙酮提取液間差異不顯著，其余各處理間差異顯著。單種提取液 95 %乙醇提取效果最好，與明華等對(duì)玉米葉葉綠素提取研究結(jié)論一致，但乙醇丙酮1∶1混合液的提取效果不及 95 %乙醇，又與明華、李得孝結(jié)論不一致。
由表6對(duì)95%乙醇提取液的3種方法提取效果比較也可看出，提取黑豆芽葉綠素以95%乙醇為提取液，以冷凍浸提效果最好。
3 結(jié)論與討論
1）研磨法、浸提法、冷凍浸提法3種方法提取黑豆芽葉綠素，對(duì)于葉綠素a、b提取結(jié)果表現(xiàn)一致，以冷凍浸提法提取效果最好，其次為研磨法，再次為浸提法，但不同提取方法間差異不顯著。盡管 3 種方法提取效果差異不顯著，但研磨法工作量大，提取時(shí)間長(zhǎng)；浸提法提取值偏低；冷凍浸提法速度快且效果好，故在黑豆芽葉綠素提取中可采用冷凍浸提法。
2）3 種提取液提取黑豆芽葉綠素，葉綠素a、b提取結(jié)果表現(xiàn)一致，以95%乙醇提取效果最好，其次乙醇丙酮1∶1混合液，再次為80%丙酮，且3種提取液提取效果差異極顯著。結(jié)合上文分析黑豆芽葉綠素以95%乙醇為提取液，以冷凍浸提效果最好。
3）本文在冷凍浸提中并未對(duì)冷凍處理的時(shí)間進(jìn)行深入研究，在對(duì)混合提取液的研究中也僅對(duì)乙醇丙酮1∶1 混合比例進(jìn)行了研究，有學(xué)者認(rèn)為乙醇丙酮1∶2提取效果好等。因此，關(guān)于此方面的工作還需進(jìn)一步研究。
